小鼠胆管类器官的体外构建：核心生长因子与信号通路的精密调控

小鼠胆管类器官是一种在体外三维培养体系中，由胆管上皮细胞或干细胞衍生、自我组织形成的微型结构。该模型能模拟胆管的上皮屏障功能、分泌特性及对损伤的应答，其成功构建与长期培养高度依赖于一套精确的细胞因子组合。

 

第一部分：关键生长因子的核心作用

 

胆管类器官的体外构建依赖于几种关键生长因子的协同作用，这些因子为细胞的增殖与形态发生提供了基础信号支持。

 

表皮生长因子（EGF）

表皮生长因子是一种高效的有丝分裂原，在胆管类器官培养中提供基础的增殖信号。EGF通过与其受体结合，激活下游的MAPK和PI3K-Akt等信号通路，直接促进胆管上皮细胞的持续分裂与扩增。这种广泛的促增殖作用为类器官的初始形成和后续传代扩增提供了必要的生长动力。

 

成纤维细胞生长因子（FGF）

成纤维细胞生长因子家族成员（特别是FGF10）是驱动胆管类器官形态构建的关键因子。FGF信号在胆管系统的胚胎发育中起着核心作用，在体外培养中同样指导着类器官的管腔形成和出芽生长。它通过调控细胞的极性建立和定向迁移，促进复杂的三维管网状结构的生成，这对于构建功能性的胆管模型至关重要。

 

第二部分：核心信号通路的精密调控

 

除了直接的生长因子，几条核心信号通路的精确平衡对胆管类器官的特异性分化与功能维持起着决定性作用。

 

Wnt/β-catenin信号通路

Wnt信号通路是启动胆管类器官形成的首要开关。适度的Wnt信号激活（通常由Wnt3a配体介导）能够诱导胆管上皮细胞的去分化和增殖，促进类器官的初始形成。然而，该通路的活性需要被严格控制在特定水平，过度或持续的Wnt信号激活反而会抑制胆管特异性标志物的表达，干扰其正常的功能成熟。

 

TGF-β/BMP信号通路

转化生长因子-β和骨形态发生蛋白信号通路在胆管类器官中构成一个精密的调控网络。与小肠类器官需要强力抑制BMP不同，胆管类器官的培养需要适度保留特定的TGF-β/BMP信号活性。这些通路在诱导胆管特异性基因表达和建立细胞极性中发挥关键作用。然而，其浓度平衡至关重要，过强的信号会诱导上皮-间质转化，导致类器官结构破坏和功能丧失。

 

第三部分：小鼠胆管类器官模型构建

 

小鼠胆管类器官完全培养基（扩增）的制备：将基础培养基、细胞因子及各类添加物按既定比例混合，配制成完全培养基。

1、原代

（1）在超净台里快速剖开小鼠腹腔，取出肝组织，置于预冷PBS（加青霉素、链霉素、原代抗生素）中清洗。

（2）将清洗后的组织块收集到1.5ml EP管中，使用无菌尖头眼科手术剪将组织块尽量剪碎(匀浆状）。组织剪切程度与消化时间相关，剪切程度越高则消化时间越短，将剪碎后的组织转移至15ml无菌离心管中。

（3）加10倍体积的组织消化液消化，37℃震荡10-30min，消化过程中随时观察情况。当视野中观察到有大量细胞漏出，且大部分细胞呈细胞团块时，可终止消化（注：不要消化到单细胞状态）。

（4）在确认消化完成的组织悬液中，加入胎牛血清（FBS）至终浓度达2-5%或终浓度为0.1%的BSA后吹打混匀。

（5）将组织与细胞悬液过70µm细胞滤网，将过滤后的细胞悬液1000rpm，离心5min，离心后去上清。

（6）若离心后沉淀中观察到明显的红色沉淀（红细胞），加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀后放置3min。加10ml PBS重悬终止裂红， 1000rpm 离心5min后，弃上清。

（7）适量基础培养基或PBS重悬沉淀。

（8）以合适的比例混合基质胶和细胞，24孔细胞培养板为例，每孔点胶25-30ul基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。

（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠胆管类器官完全培养基（扩增）进行培养。

2、类器官传代培养

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

（3）添加适量基质胶重悬类器官，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠胆管类器官完全培养基（扩增）培养。

3、类器官冻存

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

（3）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例，密度为2-3个孔冻存1管，每管体积1ml。

（4）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏

 

（1）取10ml DMEM/F12基础培养基于15ml离心管中。

（2）从液氮罐中取出冻存的类器官，快速置于 37℃水浴锅中融解。

（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。

（4）将溶解后的类器官快速转移至15ml 离心管，使用移液器轻轻吹打6-8次，1000rpm离心 5min，然后除去上清液并收集类器官沉淀。

（5）基质胶重悬，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠胆管类器官完全培养基（扩增）。

 

Cholangiocyte Organoid Expansion Cytokine Set, Mouse /小鼠胆管类器官（扩增）细胞因子套装_UA090044_优爱(UA BIOSCIENCE)官网