优爱生物：细胞因子优化方案——提升小肠类器官模型可靠性的关键技术

小鼠正常小肠类器官，作为体外研究肠上皮生物学革命的性模型，其奇迹般的生长与高度仿生的结构，完全依赖于一套精心设计的细胞因子组合。这些微小的信号蛋白，如同一位精准的“指挥家”，指挥着肠道干细胞进行自我更新、分化和组织构建，完美复现了体内小肠隐窝-绒毛轴的微观生理单元。

 

第一部分：维持干细胞干性的核心细胞因子

 

小肠类器官的培养成功，建立在几个核心细胞因子构成的“铁三角”之上，它们共同创造并维持了一个允许肠道干细胞存活的“生态位”：

 

Wnt信号：隐窝活力的“引擎”

Wnt蛋白（如Wnt3a）是维持小肠隐窝干细胞干性和增殖能力的首要信号。它持续激活下游通路，驱动细胞分裂，是类器官形成囊状和芽孢结构的最初动力，模拟了体内隐窝基底部充满活力的干细胞区。

 

spondin 1：Wnt信号的“超级放大器”

R-spondin 1通过结合细胞表面受体，极大地增强和稳定了Wnt信号通路。它与Wnt协同作用，构成了维持干细胞库稳定和促进类器官持续生长的最强效组合，确保了类器官能够无限传代而不丧失干性。

 

Noggin：塑造结构的“形态工程师”

作为骨形态发生蛋白（BMP）的抑制剂，Noggin的作用至关重要。在体内，BMP信号在隐窝顶部和绒毛处高表达，促进细胞分化。Noggin通过抑制这一信号，在类器官内部创造了一个类似隐窝底部的“低BMP区”，从而阻止干细胞过早分化，允许它们不断增殖并形成出芽的3D结构。

 

第二部分：调控细胞增殖与分化的辅助因子

 

仅有干性环境不足以形成功能性的类器官。其他细胞因子在其中扮演了精细调控分化的角色：

 

表皮生长因子：广泛增殖的“助推器”

EGF为所有上皮细胞（包括干细胞和祖细胞）提供基础的促有丝分裂信号，进一步推动类器官的整体生长和扩增。

 

Notch信号：细胞命运的“决策者”

在类器官内部，Notch信号通路的高活性倾向于促使细胞向吸收性细胞（如肠吸收细胞）分化，而低Notch活性则驱动细胞向分泌性细胞（如杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞）分化。通过调控Notch，可以影响类器官中不同细胞类型的比例。

 

第三部分：小鼠小肠类器官模型构建

 

小鼠小肠类器官完全培养基制备：将基础培养基、细胞因子（1-4）及各类添加物按既定比例混合，配制成完全培养基。

 

1.原代

 

（1）在超净台里将鼠小肠组织完整取下，放在预冷的PBS（加青霉素、链霉素、原代抗生素）中,使用灭菌后的剪刀，将肠段沿纵向剪开，然后将其展开，肠腔朝上，用盖玻片刮肠道杂质和残留物，来回两三下，用预冷的PBS冲洗小肠。

（2）用镊子捏着小肠的一端，用剪刀剪成小段，3-5mm左右，收集转移至50ml无菌离心管中，再加入预冷的PBS洗两三遍。

（3）离心管中加入30ml的5mM EDTA/PBS溶液（30mlPBS+300ul 0.5M EDTA）,小肠组织放入离心管中消化， 4℃摇床消化20-30min，期间经常镜检观察情况，有隐窝脱落为终止消化的信号，总消化时间不要超过40min。

（4）弃去消化液，加入预冷的PBS，轻轻摇晃去除EDTA。

（5）加入30ml预冷PBS含有0.1%的BSA，涡旋震荡让隐窝从小肠上掉下来。

（6）保留上清，过70µm细胞滤网，将过滤后的细胞悬液均匀的分到两个15ml离心管中，1000rpm，离心5min，离心后去上清。

（7）重复步骤5-6，2次，增加获得的隐窝数量。

（8）适量基础培养基或PBS重悬沉淀。

（9）以合适的比例混合基质胶和隐窝，24孔细胞培养板为例，每孔点胶25-30ul基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。

（10）将铺好的培养板放入37℃培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠小肠类器官完全培养基（恢复室温）进行培养。

 

2.类器官传代培养

 

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

 

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min融胶，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

 

（3）添加适量基质胶重悬类器官，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠小肠类器官完全培养基。

 

3.类器官冻存

 

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

 

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml，4℃静置20-30min融胶 ，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

 

（3）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例，密度为2-3个孔冻存1管，每管体积1ml。

 

（4）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

 

4.类器官复苏

 

（1）取10ml DMEM/F12基础培养基于15ml离心管中。

 

（2）从液氮罐中取出冻存的类器官，快速置于 37℃水浴锅中融解。

 

（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。

 

（4）将溶解后的类器官快速转移至15ml 离心管，使用移液器轻轻吹打6-8次1000rpm 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官沉淀。

 

（5）基质胶重悬，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠小肠类器官完全培养基。

 

 

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