小鼠RAW264.7细胞极化太复杂？优爱生物助你解锁M1/M2表型！

在免疫学研究的世界里，巨噬细胞无疑是战场上的“多面手”，它们既能冲锋陷阵清除病原，也能安抚灾后修复组织。而小鼠RAW264.7细胞，作为体外研究巨噬细胞功能的“明星模型”，其极化的精准调控，是揭示炎症、感染、肿瘤及组织修复等生命过程核心机制的关键。

 

第一部分：理论基石——巨噬细胞的“双重人格”

 

1.巨噬细胞极化是什么？

 

巨噬细胞极化指的是巨噬细胞在特定微环境信号刺激下，经历功能性重编程，分化为不同表型和功能亚群的过程。这并非简单的“开”或“关”，而是一个复杂的功能谱系，其中最经典的是M1型（经典活化）和M2型（替代性活化）。

 

2.为什么要对RAW264.7细胞进行体外极化？

 

机制研究： 模拟体内炎症或修复状态，研究特定基因、通路在巨噬细胞功能调控中的作用。

 

疾病建模： 体外构建M1/M2模型，用于筛选抗炎药物、研究肿瘤免疫（TAM）、或探索纤维化等疾病机制。

 

条件培养基制备： 获取M1或M2型细胞的条件培养基，用于研究其对其他细胞（如肿瘤细胞、成纤维细胞）的影响。

 

第二部分：核心武器库——塑造RAW264.7命运的「信号导航」

 

RAW264.7细胞的极化方向，完全取决于您提供的刺激组合。以下是诱导其走向M1或M2两大经典路径的核心方案：

 

1.「M1极化」：对抗病原与肿瘤

核心驱动：IFN-γ + LPS

 

IFN-γ（干扰素-γ）： 由活化的Th1细胞和NK细胞产生，是启动M1极化的“ priming signal”。

 

LPS（脂多糖）： 革兰氏阴性菌细胞壁成分，通过TLR4受体提供强烈的激活信号，是M1极化的“决定性一击”。

 

M1型细胞特征：

 

表型标志： 高表达 iNOS，产生大量一氧化氮 和促炎因子。

 

分泌谱： 高分泌TNF-α， IL-6， IL-12， CXCL9， CXCL10等。

 

功能： 强大的病原体清除能力、抗肿瘤活性、但也参与组织破坏。

 

2.「M2极化」：抗炎与组织重塑

 

M2型是一个功能相近但诱导信号不同的亚型集合，主要分为M2a， M2b， M2c等。

 

核心驱动：IL-4 / IL-13

 

核心作用： IL-4 和 IL-13 是诱导M2a亚型（主要负责过敏反应和抗寄生虫免疫，并促进组织修复）的最关键因子。

 

M2型细胞特征：

 

表型标志： 高表达精氨酸酶-1， CD206， YM1/2。

 

分泌谱： 高分泌TGF-β， IL-10， CCL17， CCL22等。

 

功能： 抑制炎症、促进细胞增殖、组织修复与重建、血管生成，但也与肿瘤进展和纤维化相关。

 

 

第三部分：实战操作篇——小鼠RAW264.7细胞极化方案

 

实验细胞：RAW264.7

 

一、M1极化

 

培养条件：6孔细胞培养板，每孔2*10^5个细胞（细胞不宜过多，否则影响极化效果），37°C，5% CO₂培养24h。将培养基更换为DMEM+2%FBS(减少血清中细胞因子的影响)，按照下表添加对应的细胞因子，37°C，5% CO₂培养24h。

 

Brand	Constituent	Final Conc (ng/ml)
UA	IFN-γ LPS	25 100
Negative control	Cell Only

 

流式检测流程：

1. 收集细胞：细胞因子干预24h后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹 打重悬，离心收集细胞。
2. 计数：用0.5ml的1%BSA重悬细胞，计算细胞总数，观察细胞活率，活率需达到95%以上。
   
   
3. 孵育抗体：加入PE Rat anti-Mouse CD86 mAb (A27137) (抗体用量参考说明书）或者同型对照，室温孵育30min 。
   
   

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。
   
   
5. 死活染料染色：每孔加入Zombie Violet™ Fixable Viability Kit (423114) (用量参考说明书），室温避光孵育15min。
   
   
6. 洗涤细胞：用1%BSA洗涤细胞，去除残留的抗体，用1%BSA重悬细胞。
   
   
7. 上机检测。

 

 

二、 M2极化

 

培养条件：6孔细胞培养板，每孔2*10^5个细胞（细胞不宜过多，否则影响极化效果），37°C，5% CO₂培养24h。将培养基更换为DMEM+2%FBS(减少血清中细胞因子的影响)，按照下表添加对应的细胞因子，37°C，5% CO₂培养24h。

 

Brand	Constituent	Final Conc (ng/ml)
UA	IL-4	20
Negative control	Cell only

 

流式检测流程：

 

1. 收集细胞：细胞因子干预24h后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹 打重悬；离心收集细胞。
   
   
2. 计数：用0.5ml的1%BSA重悬细胞，计算细胞总数，观察细胞活力，需达到95%以上。
   
   
3. 死活染料染色：离心后用PBS重悬细胞至细胞密度为1*10^7/ml，100 μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Zombie Violet™ Fixable Viability Kit (423114) (用量参考说明书），室温避光孵育15min，300Xg 离心5min，弃上清。
   
   
4. 固定：细胞用0.2mL 4%多聚甲醛重悬固定，室温避光放置15min，300Xg 离心5min，弃上清（去除残留的固定液）。
   
   
5. 破膜：细胞用0.2ml 1X破膜剂（Thermo #00-8333-56）重悬破膜，室温避光放置30min，400Xg 离心5min，弃上清。
   
   
6. 洗涤细胞：每孔加入0.2ml 1X破膜剂重悬细胞，400Xg 离心5min，弃上清；
   
   
7. 封闭：每孔加入0.1ml 1X破膜剂，并加入2μg CD16/CD32( S0B7003 )抗体进行封闭，冰上放置30min，400Xg 离心5min，弃上清。
   
   

8. 孵育抗体：每孔加入0.1ml 1X破膜剂，并加入APC anti-Mouse CD206 (MMR) mAb (A26785) (抗体用量参考说明书）或者同型对照APC Rat IgG Isotype Ctrl Antibody），室温孵育 30min，400Xg 离心5min，弃上清（去除残留的抗体）。
   
   
9. 洗涤细胞：每孔加入0.2ml 1%BSA洗涤细胞，400Xg 离心5min，弃上清，重复洗涤2次，用200μl 1%BSA重悬细胞。

10. 上机检测。

 

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