搞定T细胞激活：从“摸鱼”到“战斗”的终极开关

T细胞作为适应性免疫的核心组分，从静息状态转变为功能活化状态需要接受特异性信号的精确调控。该激活过程是细胞免疫研究及免疫疗法开发的基础环节。

 

第一部分：T细胞激活的生物学本质

T细胞激活是T细胞与抗原呈递细胞通过免疫突触结构进行信号传导的过程。此过程涉及多重信号的接收与整合，最终导致T细胞从静息状态进入增殖、分化及获得效应功能的活化状态。

 

体外激活的技术价值

• 机制研究：解析药物、基因或信号通路对T细胞命运决定的调控作用

• 治疗应用：为CAR-T、TCR-T等过继细胞疗法提供高质量的功能性T细胞

• 免疫评估：通过体外重建免疫应答，评估疫苗效果或病理状态下的T细胞功能

 

第二部分：核心要素——T细胞激活的关键信号

 

T细胞的完全活化需要三个关键信号的协同作用。

 

第一信号——抗原特异性识别

• 分子机制：T细胞受体识别抗原呈递细胞表面的MHC-肽复合物

• 技术实现：抗CD3抗体可特异性激活TCR信号通路，模拟抗原识别过程

 

第二信号——共刺激信号

• 生物学功能：确保免疫应答的特异性，防止T细胞失能或凋亡，促进细胞增殖与存活

• 技术实现：抗CD28抗体与抗CD3抗体联合使用，模拟生理条件下B7-CD28的相互作用

 

第三信号——分化调控信号

• 生物学功能：细胞因子微环境决定T细胞分化为不同功能亚群的方向

• 技术实现：IL-2作为关键生长因子，在多数培养体系中支持T细胞的克隆性扩增

 

以上三个信号级联放大，共同完成T细胞的完全活化与功能分化，为免疫学研究与临床应用提供基础技术支撑。

 

第三部分：小鼠与人T细胞激活极化方案

 

A.人T细胞激活方案

 

方案1：抗人CD3单克隆抗体固定方法

 

1. 将NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体稀释至PBS中，最终浓度为5µg/mL。
2. 将稀释后的NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体按每孔1mL加入24孔板中固定。
   
   
3. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。
   
   
4. 从24孔板中移除NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体。
   
   
5. 准备人外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。
   
   
6. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤5中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：
   
   

- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD28单克隆抗体

- 10ng/mL人白细胞介素-2（IL-2）蛋白

7. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。
   
   
8. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。
   
   
9. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。
   
   
10. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。
    
    
11. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（BSA）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。
    
    
12. 用10µg人IgG抗体阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。
13. 根据说明书加入Brilliant Violet 421™抗人CD25抗体（302630）和Alexa Fluor® 488抗人CD69抗体（310916），在4°C下孵育30分钟。
    
    
14. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。
    
    
15. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>10000个细胞）。

 

方案2：抗人CD3单克隆抗体游离方法

 

1. 准备人外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。
   
   
2. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤2中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：

- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体

- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD28单克隆抗体

- 10ng/mL人白细胞介素-2（IL-2）蛋白

3. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。
   
   
4. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。
   
   
5. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。
   
   
6. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。
   
   
7. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（BSA）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。
   
   
8. 用10µg人IgG抗体阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。
   
   
9. 根据说明书加入Brilliant Violet 421™抗人CD25抗体（302630）和Alexa Fluor® 488抗人CD69抗体（310916），在4°C下孵育30分钟。
   
   
10. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。
    
    
11. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>10000个细胞）。

人T细胞激活试剂盒/CellXViva Human T cell Activation Kit_UA090033_优爱(UA BIOSCIENCE)官网

 

 

B.小鼠T细胞激活方案

 

方案1：抗小鼠CD3单克隆抗体固定方法

 

1. 小鼠T细胞生长培养基营养系统：

- RPMI 1640培养基，ATCC改良型（含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和HEPES）

- 12%优级胎牛血清

- 1%抗生素-抗霉菌剂

- 细胞冻存：免疫细胞无血清冻存培养基

• 注意：上述培养基系统仅供参考。
  

2. 将NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb稀释至PBS中，最终浓度为5µg/mL。
   
   
3. 将稀释后的NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb按每孔1mL加入24孔板中固定。
   
   
4. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。
   
   
5. 从24孔板中移除NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb。
   
   
6. 准备小鼠脾脏的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。
   
   
7. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤6中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：

- 5µg/mL NA/LE Syrian Hamster anti-mouse CD28 mAb

- 10ng/mL IL-2 Protein, Mouse

8. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。
   
   
9. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。
   
   
10. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。
    
    
11. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。
    
    
12. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（BSA）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。
    
    
13. 用10µg小鼠IgG抗体阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。
    
    
14. 根据说明书加入FITC大鼠抗小鼠CD25抗体（S-R441）（S0B5215），在4°C下孵育30分钟。
    
    
15. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。
    
    
16. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>10000个细胞）。

 

小鼠T细胞激活试剂盒/CellXViva Mouse T cell Activation Kit_UA090032_优爱(UA BIOSCIENCE)官网