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生物素标记是常用的蛋白标记方法，是指在特定的蛋白或底物上偶联生物素分子，利用生物素和链霉亲和素的高亲和力进行信号放大和检测。
生物素(Biotin B，辅酶A或维生素H)和链霉亲和素发现于20世纪60年代，两者的亲和力可达到10-14M至 10-15 M，并且可以在蛋白变性条件下识别并结合，比如1%的十二烷基硫酸钠(SDS)、100mM DTT等条件下。
生物素标记可分为化学方法和生物方法，采用化学方法进行生物素标记缺乏位点特异性，并且可能会导致蛋白失活。生物酶催化生物标记具有高特异性、高效性，是目前常用的生物素标记方法。
BirA是来源于原核生物大肠杆菌的一种生物素连接酶，可以特异性地将生物素共价连接到Avi tag(15个氨基酸GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上。动力学实验表明，采用Avi作为底物的反应速度是BirA天然底物BCCP(生物素羧基载体蛋白)的两倍。
图1：生物素标记原理示意图
生物素标记已经在ELISA实验、SPR分子互作检测、BLI分子互作检测、分子生物学、组织化学等方向有广泛应用。
生物素标记步骤如下：
- 按照如下反应体系要求，将Avi标签蛋白、缓冲液(UA070015)、BirA(UA070015)混合
| 250μl体系 | ||
| 建议Avi标签蛋白浓度~40μM | ||
| 名称 | 含量 | |
| 01 | Avi标签蛋白 | 10nmol(40μM) |
| 02 | 10XBuffer A | 25μl |
| 03 | 10XBuffer B | 25μl |
| 04 | 10XBuffer C | 25μl（若需要）* |
| 05 | BirA | 2.0μg |
| 06 | ddH2O | 至250μl |
*如果Avi标签蛋白浓度介于40~80μM，建议添加Buffer C
2. 混合以上组分后，37℃孵育。在30分钟、60分钟、90分钟时分别取20μl进行分析。(如需要，可取更多时间节点)
3. 采用PullDown或其他生物素定量试剂盒进行分析。
4. 优爱生物测试PullDown结果展示：
10nmol(40μM) Avi-tagged protein substrate were labeled by 2μg BirA at 37℃ for 30min. All sample lanes are loaded 4μg protein, respectively.
Streptavidin has 4 biotin-binding sites, and may associate with 1 to 4 chains of the biotinylated protein. Therefore, the extent of protein biotinylation can be calculated based on the ratio of biotinylated protein to original substrate protein.
BirA酶纯度:>95% by SDS-PAGE&HPLC
2μg（N: non-reducing condition, R: reducing condition).
Kit Components (200 µg Specification) |
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优爱蛋白（UA Bio）,重组蛋白专家
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