干细胞培养步骤

NSCs(神经干细胞)是一类能够长期自我更新的多能干细胞，并在一定条件下具有分化的多潜能特征，可以形成神经元、星角质细胞和少突胶质细胞。

那么如何进行神经干细胞培养分化？

新生1d清洁级SD大鼠，体重8-10g。

2.试剂

细胞基础培养基DMEF/F12、B27、N2、bFGF、EGF、小牛血清

脱颈处死24h之内新生SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，超净台上取脑，迅速放入冰浴盛有D-hank’s的平皿中;

参照老鼠解剖图谱剔除脑膜和血管，取出海马体组织；

用D-Hank’s液，清洗三遍后将组织尽可能剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶消化15mins，吹打后加入胎牛血清终止消化；

用200目筛网过滤，1000r/min离心8min；

弃上清，管底的白色沉淀即为单细胞，进行活细胞计数。

将单细胞沉淀用含血清培养基重悬，培养24h后去除表面漂浮的死细胞，并换为含有B27(1:50)、N2(1:200)、EGF(2ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、1%的牛血清白蛋白的DMEM/F12(1:1)无血清培养基培养，按5X10⁵/ml接种于25ml培养瓶中，每瓶4ml，37℃，5%CO2中培养，每2-3d根据细胞生长情况半换液。5-7d部分细胞接种于35mm培养皿中培养(内含多聚赖氨酸包被的盖玻片)，用于免疫细胞化学的检测，部分进行传代。

>>>神经球分化后可以用神经元标记物、星形胶质细胞标记物(GFAP)、少突胶质细胞标记物(PDGFR)等来进行子代细胞的免疫荧光染色，判断所得到的细胞是否具有多向分化潜能。EGF和bFGF是促进NSCs增殖最常用的生长因子，两者具有丝裂原的作用，能够促进细胞的生长、分裂并可以缩短群体倍增时间。

造血干细胞具有自我更新和分化为血液及免疫系统中各种成熟细胞的能力因而成为基因治疗理想的靶细胞。

1.材料及试剂

C57和ICR小鼠购自于第二军医大学实验动物中心

重组细胞因子：小鼠IL-3，人IL-6，小鼠SCF

颈椎脱臼法处死细胞，取其股骨和胫骨，在关节处切开谷骨骼，反复用培养基冲洗骨髓腔。

随后小心地将细胞悬液加在淋巴细胞上分离液上，2000r/min离心20分钟，

吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。

3.Lin^-c- Kit⁺造血干细胞的分离纯化：a:去除Lin+细胞(负筛选) b:收集CD117⁺细胞(正向筛选)。

4.MNCs和HSCs的体外培养

(1)MNCs(单个核细胞)体外培养：

用含有10%的小牛血清的高糖DMEM培养基，MNCs以5X10⁴个/ml接种于24孔板中，每孔1ml；

(2)HSCs(造血干细胞)体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1X10⁴个/ml接种于24孔板中，其中一组添加重组细胞因子：rmIL-3，rhIL-6，rmSCF 50ng/ml。

两种细胞均置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。

5.结果

MSCs体外悬浮培养，未添加细胞因子的情况下，2-3d仍可形成大量的CFU-GM（40个以上细胞组成的细胞团为一个集落，颜色淡黄）。

HSCs经磁珠分离纯化后得到约10⁵Lin^- 个CD117⁺的造血干细胞，添加细胞因子的实验组造血干细胞数和集落数呈逐渐增加的趋势，未添加细胞因子的对照组细胞数量无明显增加，集落数明显少于实验组。在第三周时细胞基本死亡。

除了以上使用的小鼠IL-3，人IL-6，小鼠SCF，其他用于造血干细胞培养的细胞因子包括SCF、FLT3、TPO、G-CSF、GM-CSF等。

-参考资料：

-造血干/组细胞的体外扩增培养研究

-小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达。